Полиморфизм генов системы гемостаза: методика исследования и интерпретация результатов

Aнализы на генетические полиморфизмы при выкидышах и замерших беременностях в первом триместре

Поскольку 80%[1] потерь приходятся на первые три месяца беременности, только этих ситуаций мы коснемся в статье. Причины потери беременности после 12 недель – предмет отдельного обсуждения.

Полиморфизм генов системы гемостаза: методика исследования и интерпретация результатов

Непросто поверить, но риск спонтанного прерывания беременности на сроке 6-12 недель у здоровой женщины моложе 35 лет составляет не менее 10%[2], и повлиять на причины этих событий можно в меньшинстве случаев.

Итак, женщина понимает: ребенка не будет. Одно из первых желаний в такие моменты – узнать причину. И находятся желающие эту потребность удовлетворить: ошарашенной женщине назначают многочисленные обследования и анализы, и редко обходится без тестов на:

  • «генетические причины потери беременности»
  • «полиморфизмы в генах гемостаза и фолатного цикла»
  • «мутации предрасположенности к невынашиванию беременности»
  • «генетический риск осложнений беременности»

Вариантов названий у этой услуги множество. Суть одна: по материалу матери определяют ее генотип по полиморфизмам нескольких генов.

Когда женщине назначают «генетические анализы» по поводу потери беременности — это в 99% случаев именно анализы на полиморфизмы. Поэтому (с определенным допущением) можно сказать, что анализы на полиморфизмы = генетические анализы, которые назначаются женщинам по поводу потери беременности.

Непросто в двух словах рассказать, что такое полиморфизмы. Полиморфизмы – это незначительные различия в структуре генов, определяющие разнообразие их проявлений. Каждый конкретный полиморфизм «живёт» в определенном гене, немножко изменяя свойства его продукта и, тем самым, проявление какого-то признака.
Полиморфизм генов системы гемостаза: методика исследования и интерпретация результатов
Полиморфизмы – это то, что делает нас разными. Это генетические оттенки, из-за которых один может за милую душу выпить литр молока, а другой после пары глотков будет искать туалет. Благодаря полиморфизмам у нас столько цветов глаз и волос. Из-за них у кого-то кровь сворачивается чуть быстрее среднего, а у кого-то – чуть медленнее. Удивительно, но весь этот спектр форм, цветов и особенностей задается комбинациями четырех букв-нуклеотидов, составляющих наши гены: A, G, T и C. Одну букву мы получаем от мамы, другую – от папы. Так получается наш собственный генотип: например GG, GA или TC. Результатом анализа на полиморфизмы как раз и будут пары букв.
Например, в гене фактора свертывания крови V (этот ген называется F5) буквой под номером 1691 может быть G, а может – А. Отсюда три варианта генотипов: GG, GA и AA. Вариант GG — удел большинства людей, ему не свойственны какие-то особенности. Около 2-7% людей имеют генотип GА, то есть несут полиморфизм А (так называемую Лейденскую мутацию), из-за чего склонны к повышенной свертываемости крови. Людей с генотипом АА крайне мало.
Грань между понятием «мутация» и «полиморфизм» тонка и неопределенна. Ученые-биологи любое отклонение от «эталона» могут называть мутацией, а врачи-практики обычно считают мутацией только то изменение, которое может приводить к болезни. Поэтому не смущайтесь, что полиморфизм в гене F5 называют Лейденской мутацией.

Какие полиморфизмы обычно обсуждаются в контексте потери беременности?

Назовём героев этой статьи поимённо!

Не пугайтесь того, что эти названия вам ни о чем не говорят, и пока что поверьте: они и врачу вашему в большинстве случаев ничего не скажут.

  • F5: 1691 G>A (Arg506Gln)NB!
  • F2: 20210 G>A NB!
  • F7: 10976 G>A (Arg353Gln)
  • F13: G>T (Val34Leu)
  • FGB: -455 G>A
  • ITGA2: 807 C>T (Phe224Phe)
  • ITGB3: 1565 T>C (Leu33Pro)
  • SERPINE1 (PAI-1): -675 5G>4G
  • MTHFR: 677 C>T (Ala222Val)
  • MTHFR: 1298 A>C (Glu429Ala)
  • MTR: 2756 A>G (Asp919Gly)
  • MTRR: 66 A>G (lle22Met)

NB! Обратите внимание, что эти два полиморфизма могут играть важную роль в принятии решения о назначении КОК (комбинированных оральных контрацептивов).

Почему врачи назначают анализы на эти полиморфизмы?

Когда ученые узнали о существовании полиморфизмов, они задумались: а нельзя ли использовать это знание для выделения группы людей с предрасположенностью к определенным заболеваниям, и заблаговременно их предупреждать? Известно же: предупредить легче, чем лечить!

Эти времена совпали с подъемом молекулярных технологий, позволивших выполнять тесты на полиморфизмы относительно просто и недорого. Исследователи смекнули, что работы типа «Влияние полиморфизма Х на болезнь Y» генерировать легко и делать это можно практически бесконечно.

Поскольку болезней и полиморфизмов много, всегда была возможность подобрать пару «полиморфизм – болезнь», позволявшую даже из безнадежных данных вытащить мало-мальски значимую связь и опубликоваться, кокетливо умолчав об изъянах дизайна исследования.

Соедините немного логики и статистики – и получите скромное, но научное достижение.

Вот как рассуждали эти исследователи: уже упоминавшаяся Лейденская мутация связана с повышенной свертываемостью крови. Известно, что формирование и функционирование плаценты сильно зависит от агрегатных свойств крови, а при невынашивании беременности в плацентах нередко находят очаги тромбоза.

Логично предположить, что у носительниц Лейденской мутации эти нарушения могут встречаться чаще. Осталось провести исследование и проверить эту гипотезу. Такие исследования были проведены и некоторые показали наличие связи между наличием Лейденской мутации и повышенным риском потери беременности.

Так появилась богатая (на немалую долю отечественная) «литературная база», указывающая на связь между полиморфизмами и предрасположенностью к разным болезням.

Именно на эту «базу» опирались производители реагентов при убеждении врачей в целесообразности назначения тестов на полиморфизмы.

Да-да, на определенном этапе потребность в диагностикумах для анализов на полиморфизмы стала так велика, что привлекла производителей реагентов, которые создали коммерческие наборы для выполнения этих тестов. А товар требует продвижения.

Как можно расширить рынок таких наборов? Внедрить тесты на полиморфизмы в клиническую практику! И эти анализы из научных лабораторий стали «заползать» в диагностические.

Когда результаты научных исследований переносятся в клиническую практику без должной оценки последствий, страдают кошельки и нервы пациентов.

Так появились лаборатории, предлагающие тесты на полиморфизмы как медицинские диагностические услуги. Так появились врачи, наученные лабораториями и производителями реагентов, что эти тесты нужно назначать в различных случаях, в том числе при невынашивании беременности. Так сформировалась целая мифология про то, какие полиморфизмы надо выявлять и как их «лечить».

Но достаточно мифов. Дальше — только факты:

Полиморфизм генов системы гемостаза: методика исследования и интерпретация результатов

1. Полиморфизмы не являются значимой причиной ранней потери беременности

Около 70% беременностей, прервавшихся в первом триместре, не могли развиваться из-за генетических аномалий ЭМБРИОНА (не матери!!!)[3]. Не путайте с генетическими полиморфизмами!

Полиморфизмы – это генетические особенности мамы, а приводящие к выкидышу нарушения структуры и количества хромосом – это грубые аномалии эмбриона. Возникновение таких эмбрионов – часть жизни, так же, как и их ранняя отбраковка.

Оставшиеся 30% ранних потерь беременности тоже не имеют отношения к полиморфизмам, а обусловлены антифосфолипидным синдромом, неправильным функционированием шейки матки, инфекциями и другими причинами, к которым генетические полиморфизмы матери не относятся.

2. Какие-то полиморфизмы есть у всех людей

В отличие от мутаций, вызывающих редкие генетические болезни, которые встречаются у одного из десятков тысяч людей, какие-то полиморфизмы есть у всех. Каждый день мимо вас проходят люди с такими же GG, GA и TC, как у вас.

Возможно, у них есть дети, но может быть и нет. Есть вероятность, что они сталкивались с потерей беременности, а может быть их это несчастье обошло стороной.

В любом случае: от вас они отличаются тем, что не тратили деньги на анализ полиморфизмов.

3. Полиморфизмы не определяют признак полностью (или на большую часть)

Вернемся к несчастным больным генетическими заболеваниями: их редкий генетический дефект практически на 100% определяет их беду. То, что генетики называют «факторами среды» (поведение, питание, физическая активность) вносит очень маленький вклад в их несчастье. С полиморфизмами наоборот: их вклад очень мал.

Например, вероятность развития венозного тромбоза хоть в некоторой степени и зависит от наличия, например, уже знакомой нам Лейденской мутации, но на львиную долю определяется весом, статусом курения, возрастом, наличием беременности, принимаемыми препаратами и другими факторами.

Читайте также:  Анализ мочи на натрий

4. Полиморфизм – не болезнь

Какими бы жуткими словами не сопровождались комбинации из букв A, G, T и C в заключении генетического анализа, они НЕ говорят о том, что у женщины будет, например, «невынашивание беременности».

Пример из жизни:

Когда на бланке результата «Нарушение развития плода – незаращение нервной трубки» написано рядом с «MTRR c.66A>G G/G» любой человек поймёт такую запись как причинно-следственную связь. А это не так.

Наличие полиморфизмов говорит лишь о том, что вы принадлежите к людям, у которых по данным некоторых(!) научных(!!!) исследований эти патологии возникают чаще, чем у людей без ваших полиморфизмов.

И тут мы переходим к следующему факту…

5. Влияние полиморфизмов «видно» только на больших группах людей

Даже будучи специалистом, я не пойму ваш генотип по генам свертывания крови, увидев вашу коагулограмму (анализ на свертываемость крови). А всё потому, что эти различия не «видны» на индивидуальном уровне.

У человека с «плохими» полиморфизмами свертывание может быть «лучше», чем у «генетически идеального».

Лишь среднее значение этого показателя, измеренное в большой группе людей с «плохим» генотипом, будет отличаться от такового у группы с «хорошим».

Немного математики: Иногда в заключении анализа рядом с жуткими «диагнозами» можно увидеть цифры. Например, «Выявленный полиморфизм в 3,5…5,5 раз увеличивает риск венозной тромбоэмболии». Эти цифры – совершенно честные[4] для Лейденской мутации. Этот полиморфизм – один из двух достойных хоть какого-то внимания полиморфизмов системы свертывания крови. Второй – так называемый «полиморфизм протромбина», c.20210G>A в гене фактора свертывания крови II (F2).
Но вернемся к цифрам. Увеличение в 3,5…5,5 раз – это существенно? Конечно существенно! Если мне завтра в три с половиной раза увеличат зарплату, это будет ой как существенно…
А если посмотреть не относительный, а абсолютный риск? Когда у вас есть Лейденская мутация, ваш ежегодный риск получить венозную тромбоэмболию равен 0,05…0,2%. Иными словами:

  • Наличие Лейденской мутации означает,
  • что с вероятностью 99,95…99,80% у вас
  • НЕ будет венозной тромбоэмболии (ВТЭ) в течение следующего года

Абсолютный риск ВТЭ настолько мал, что даже увеличение в разы не делает его существенным для жизни отдельного конкретного человека. Беременность в совокупности с Лейденской мутацией повышает риск ВТЭ, но шанс на то, что тромбоза НЕ будет, всё равно не опускается ниже 95%.

И теперь пара слов о лечении:

1. «Вылечить» полиморфизмы нельзя

Это часть генотипа, и он останется неизменным до конца жизни. Поэтому тактика «сдать на полиморфизмы – полечить – сдать контрольный анализ» абсурдна по своей сути.

2. Ни один из полиморфизмов не является прямым поводом для назначения лечения

Справедливости ради, стоит отметить, что при невынашивании беременности антикоагулянтная терапия может потребоваться, и она дает неплохие результаты. Но для назначения антикоагулянтов должен быть установлен диагноз «антифосфолипидный синдром» (который может сочетаться или не сочетаться с полиморфизмами в генах системы свертывания).

3. Курантил, актовегин, тромбоасс, пиявки не нужны

Они не имеют доказанной эффективности в улучшении исходов беременности у женщин с полиморфизмами в системе свертывания.

Тестирование женщин даже с неоднократной потерей беременности на наследственные тромбофилии[5] и полиморфизмы фолатного цикла[6] не входит в рекомендации ведущих медицинских организаций, занимающихся этой проблемой. Но в большинстве отечественных «методичек»  и рекомендаций по невынашиванию беременности эти исследования входят.

И чтобы не оставлять неопределенности:

Анализы на генетические полиморфизмы женщинам, столкнувшимся с потерей беременности один или несколько раз, делать не нужно

Источники:

[1]https://www.acog.org/Resources-And-Publications/Practice-Bulletins/Committee-on-Practice-Bulletins-Gynecology/Early-Pregnancy-Loss

[2] https://www.webmd.com/baby/guide/pregnancy-miscarriage#1

[3] http://emedicine.medscape.com/article/260495-overview#a11

[4] Scott M. Stevens et al. Guidance for the evaluation and treatment of hereditary and acquired thrombophilia. J Thromb Thrombolysis (2016) 41:154–164

  1. [5] Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion
  2. [6] Thrombophilias and recurrent pregnancy loss: a critical appraisal of the literature
  3. Карпачева Клавдия, молекулярный генетик

Система свертывания крови. Исследование полиморфизмов в генах: F5 (мутация Лейден, Arg506Gln) и F2 (протромбин 20210 G>A)

В случае же если для исследования полиморфизмов в генах F2 и F5 важен метод пиросеквенирование, то рекомендуется заказывать профиль 180014.

Склонность к повышенной коагуляции и формированию тромбов (тромбофилия) — глобальная медико-социальная проблема, основная причина смертности и инвалидизации во многих развитых странах мира. Частота венозных тромбозов в общей популяции, согласно мировым данным, составляет 1-2 случая на 1000 человек ежегодно.

В настоящее время хорошо изучены различные формы тромбофилии, выявлена наследственная составляющая заболевания и установлены причины заболевания на молекулярно-генетическом уровне.

Наиболее значимыми и часто встречающимися наследственными дефектами в системе гемостаза, приводящими к тромбофилии, являются полиморфизмы в генах, кодирующих коагуляционный фактор 5 (F5) и коагуляционный фактор 2 (F2, протромбин). Наличие одновременно двух полиморфизмов повышает риск тромбоза почти в 100 раз.

Также носительство данных полиморфизмов увеличивает вероятность развития гестоза, фетоплацентарной недостаточности, отставания развития плода, мертворождения.

Существуют данные о повышении частоты встречаемости этих полиморфизмов у женщин с привычными выкидышами, особенно во II триместре беременности. Полиморфизмы достоверно ассоциированы с ранним и поздним привычным невынашиванием.

Один из факторов риска развития тромбофилии у носителей полиморфизмов — прием комбинированных оральных контрацептивов.

Показания к исследованию:

  • Планирование любых оперативных вмешательств.
  • Рецидивирующие венозные тромбозы.
  • Тромбозы в молодом возрасте (до 40 лет).
  • Варикозная болезнь вен нижних конечностей.
  • Прегравидарная подготовка.
  • Тромбоэмболические осложнения при беременности или на фоне приема комбинированных оральных контрацептивов.
  • Женщины с отягощенным гинекологическим анамнезом (преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты, плацентарная недостаточность, гестозы, невынашивание, мертворождение, неудачи ЭКО в анамнезе и т.п.).
  • Беременные с сопуствующей экстрагенитальной патологией (ревматические пороки сердца, заболевания почек, артериальная гипертензия, метаболический синдром, воспалительные процессы различной локализации и т.п.).
  • Беременные старшей возрастной группы (более 35 лет) с индуцированной беременностью, многоплодием.

Генетический риск нарушений системы свертывания крови

Система свертывания крови, или гемостаз, в организме человека выполняет одну из важнейших функций. С одной стороны — защищает от кровотечений (противосвертывающий компонент системы), с другой — предупреждает (свертывающий компонент) образование тромбов (сгустков крови). В норме свертывающий и противо-свертывающий компоненты системы гемостаза уравновешены, что позволяет крови находиться в жидком состоянии и одновременно препятствовать кровопотерям и тромбозам.

Дефекты в системе свертывания крови (гемостаза) могут быть генетическими, то есть переданными по наследству, иприобретенными. Нарушения гемостаза могут предрасполагать как к кровоточивости и кровотечениям (например, всем известная гемофилия), так и к повышению свертывания крови (тромбофилии). Последние наблюдаются гораздо чаще. С такими нарушениями часто встречаются акушеры-гинекологи, поскольку многие осложнения беременности и родов сопровождаются кровотечениями и тромбозами. В последние годы установлено, что нарушения свертывания крови, как генетически обусловленные, так и приобретенные при многих аутоиммунных заболеваниях, могут быть причиной внутриутробной гибели плода, невынашивания беременности, бесплодия, серьезных осложнений беременности (гестозов, преждевременной отслойки плаценты, анемии и др.). Исследование системы свертывания крови в таких случаях позволяет дать ответ на многие неясные вопросы.

К приобретенным нарушениям гемостаза приводят длительные хронические инфекции, стрессы, травмы, ожирение, эндокринные и онкологические заболевания, длительный прием некоторых лекарственных средств. Среди вредных привычек, приводящих к изменениям свертывания крови, приводит курение. Недаром в группе риска развития инсульта и инфаркта курение рассматривается одной из ведущих причин. Курение приводит к усилению свертывания крови и предрасполагает к тромбозам, а это, в свою очередь, служит ведущим механизмом инсульта и инфаркта. Ситуация еще более усложняется, если у курильщика имеются генетические дефекты свертывающей системы. С возрастом также повышается активность свертывающего компонента гемостаза. Поэтому возраст также является фактором риска развития инсультов и инфарктов.

К наиболее частым причинам нарушения свертывания крови относятся:

— антифосфолипидный синдром — патология, при которой происходит образование антител к фосфолипидам собственного организма. Проявления антифосфоли-пидного синдрома включают в себя не только акушерские осложнения (ранние выкидыши, гестоз, плацентарная недостаточность и др.), но и различные сердечнососудистые, неврологические, кожные проявления.

— наследственные нарушения гемостаза в результате нарушения структуры опеделенных генов (мутация Лейдена, гипергомоци-стеинемия, дефициты естественных проти-восвертывающих белков — протеинов С, S и антитромбина III и др.

В норме беременность сопровождается повышением свертывания крови, особенно на последних сроках. Это является приспособлением, которое препятствует патологической кровопотере во время родов. При наличии нарушений гемостаза, предрасполагающих к тромбозам, беременность без соответствующей коррекции этих нарушений часто сопровождается серьезными осложнениями: гестозами, преждевременной отслойкой плаценты, угрозой прерывания беременности, выкидышами на разных сроках и преждевременными родами, а также увеличением риска смерти от инсульта и инфаркта вследствие образования тромбов. Нарушения гемостаза вообще могут никак не выдавать себя до беременности, а проявиться именно в период беременности, при каких-либо оперативных вмешательствах или при использовании гормональной контрацепции.

Беременность вообще может не наступить, поскольку такие нарушения приводят к потере эмбриона на ранних стадиях (особенно при антифосфолипидном синдроме) вследствие невозможности оплодотворенной яйцеклетки имплантироваться в слизистую оболочку матки. Это называется преэмбрионической потерей плода. Клинически это проявляется очередной менструацией, а женщина остается бесплодной с диагнозом «неясная форма бесплодия».

Ранее считалось, что тромбозы непредотвратимы. Теперь же с появлением современной диагностики и высокоэффективных препаратов появилась возможность их предупреждения. Исследование системы свертывания крови позволяет заблаговременно прогнозировать риск осложнений беременности и принять меры для их предупреждения. Исследование гемостаза рекомендуется всем женщинам, планирующим беременность, особенно тем, кто страдает ожирением, гипертонической болезнью, варикозным расширением вен, бесплодием; у кого были в прошлом невынашивания беременности и преждевременные роды, мертворож-дение, осложнения во время предыдущих беременностей и родов, неудачные попытки экстракорпорального оплодотворения, чьи мамы и бабушки имели осложнения беременности. Некоторые важные методы диагностики (особенно определение генетических форм тромбофилии) остаются очень сложными и дорогими, а поэтому не всегда доступными. Тем не менее большим достижением является то, что зная ту или иную патологию гемостаза еще до беременности или на самых ранних ее сроках, можно провести профилактическое лечение и добиться наступления беременности, пролонгирования беременности до оптимального срока родов у женщин с невынашиванием и даже спасти жизнь Вам и Вашему будущему ребенку.

На сегодняшний день используется целая группа лекарственных препаратов еще на этапе планирования беременности.

К ним относятся препараты, препятствующие агрегации тромбоцитов, антикоагулянты, полиненасыщенные жирные кислоты, антиоксиданты, фолиевая кислота и витаминно-минеральные комплексы. Ту или иную терапию назначают в зависимости от формы и степени нарушения гемостаза индивидуально.

Лечение продолжается в течение всей беременности. В этом случае вероятность благополучного исхода беременности высока и при правильном и своевременном лечении достигает 95%.

Полиморфизм генов гемостаза у мужчин и женщин с бесплодием

Обследованы супружеские пары и женщины с диагнозом «бесплодие».

Определены частоты частоты аллелей и генотипов в трех генах фолатного обмена (MTHFR C667T, MTR А2756G, MTRR A122G) и протромбина (FII A20210G).

У мужчин отмечается увеличение частоты полиморфных аллелей MTHFR 667T и MTR 2756C, а также генотипов, содержащих эти аллели и их сочетания.

Наличие в генотипе сочетаний  низкофункциональных аллелей MTHFR 667T+ MTR 2756C, MTHFR 667T + MTRR A66G , MTR 2756C + MTRR A66G генов фолатного обмена и FII 20210G ассоциированы с нарушением репродуктивности и имеет клинические проявления в нарушении гемостаза у мужчин и женщин.

Ключевые слова: бесплодие, MTHFR, MTR, MTRR, FII, гемостаз.

Married couples and women with the diagnosis «fruitlessness» are surveyed. Frequencies of frequency alleles and genotypes in three genes folate an exchange (MTHFR C667T, MTR А2756G, MTRR A122G) and coagulation factor II (thrombin) (FII A20210G) are defined.

At men the increase in frequency polymorphic alleles MTHFR 667T and MTR 2756C, and the genotypes, containing these alleles and their combinations is marked.

Presence in a genotype of combinations small functional alleles MTHFR 667T + MTR 2756C, MTHFR 667T + MTRR A66G, MTR 2756C + MTRR A66G genes folates an exchange and FII 20210G is associated with infringement fertility also has clinical displays in homeostasis infringement.

Keywords: bareness, MTHFR, MTR, MTRR, FII, a homeostasis.

Введение

В настоящее время одной из значительных проблем в медицине является нарушение мужской и женской фертильности. Бесплодие встречается у пятой части супружеских пар, а привычное невынашивание беременности (ПНБ) составляет 20% от общего числа беременностей. При этом около трети случаев бесплодия не поддаются лечению, так как невозможно установить истинные причины нарушения [2].

Большое влияние на нормальное развитие репродуктивной функции мужчин и женщин, способность к оплодотворению и правильное развитие беременности оказывает ряд генов, относящихся к фолатному обмену (MTR, MTRR, MTHFR), системе свертываемости крови (FII) [3].

Известно, что гены фолатного обмена участвуют в синтезе фолиевой кислоты, которая стимулирует созревание эритроцитов. Уровень фолатов в эритроцитах является наиболее информативным показателем дефицита фолатов [12].

При нарушениях метаболизма гомоцистеина вследствие генетических дефектов ферментов фолатного обмена гомоцистеин накапливается внутри клеток в повышенных количествах, что оказывает цитотоксический эффект на клетку. Это может приводить к спонтанным абортам,  венозной тромбоэмболии [1].

Гены системы свертываемости крови, влияют на свертываемость крови и склонность к тромбообразованию. В тромбоцитах содержится 12 факторов свертывания крови. В условиях генетически обусловленного гипофибринолиза, активации внутрисосудистого свертывания крови происходит десинхронизация процессов фибринолиза и фибринообразования при имплантации,[5].

Эозинофильные гранулоциты провоцируют дегрануляцию базофильных гранулоцитов и в активном состоянии вырабатывают лейкотриены.

Некоторые из катионных белков эозинофилов связываются с гепарином и снижают его антикоагулянтную активность, что может привести к увеличению свертываемости крови, и, как следствие, тромбообразованию.

Появление тромбов в кровотоке матки может препятствовать кровоснабжению плода, что, в свою очередь, может привести к ПНБ [6],[7].

Материалы и методы исследования

В исследование включены 56 пациентов областного центра планирования семьи, женских консультаций, (женщин- 41 , мужчин- 15) в возрасте от 20 до 45 лет, проживающих в Ростове-на-Дону.

Среди них было 12 супружеских пар с диагнозом бесплодие и 16 женщин с нарушением фертильной функции (в анамнезе привычное невынашивание беременности, бесплодие I или II степени).

В контрольную группу включены 3 фертильные супружеские пары (имеющие как минимум одного родного ребенка) и 10 женщин без репродуктивных проблем.

Материалом для исследования служила венозная кровь, забранная Vacuette с ЭДТА из локтевой вены утром натощак в количестве 3 мл. Выделение ДНК и последующие молекулярно-генетические исследования проводились методом полимеразно-цепной реакции.

Для выделения ДНК из лимфоцитов периферической крови использовали коммерческий набор реагентов DIAtom™ DNA Prep 100.

Исследование полиморфизма 677 C->T (A223V) гена метилентетрагидрофолат-редуктазы (MTHFR), D919G A->G гена метионинсинтазы (MTR), I22M A->G гена метионинсинтазы-редуктазы (MTRR), 20210 G->A гена протромбина (F2) из полученной ДНК проводили с использованием набора реагентов SNP-экспpecc (Литех, Москва).

Разделение продуктов амплификации проводили методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. Анализ электрофореграмм проводили под УФ на трансиллюминаторе BioRad.

Выполняли общий анализ крови с подсчетом числа эритроцитов, гемоглобина. Полуавтоматическим методом на спектрофотометре SmartSpec (BioRad), лейкоцитов в счетной камере Горяева, унифицированным микрометодом определения СОЭ.

Фиксированные препараты крови готовили при помощи красителей: эозин-метиленовый синий по Май-Грюнвальду (в растворе) и азур-эозина по Романовскому (ЭКОлаб), бриллиантового крезилового синего (ЭКОлаб).

Цитологическое исследование морфологии форменных элементов и подсчет лейкоцитарной формулы крови проводили на лабораторном микроскопе Axioskor 40/ Axioskor 40 FL (Carl Zeiss).

Статистическую обработку полученных данных с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0. Работу проводили на базе НИИ Биологии ЮФУ и КДЛ «Наука».

Результаты и обсуждение.

В группе  мужчин с нарушением репродуктивной функции отмечается статистически значимое увеличение в 2 раза частоты полиморфного  аллеля 667Т в гене MTHFR (метилентетрагидрофолат-редуктазы)  и 2756G в гене MTR.

Генотип 122M (G/G и А/G) в гене MTRR был более частым в контрольной группе, у мужчин из группы бесплодных пар он встречался значительно реже. Отсутствие достоверного уровня значимости возможно за счет малого размера выборки.

Полиморфный аллель 20210 G/A фактора свертываемости II (FII) у мужчин с нарушение репродуктивной функции  вообще не встретился, тогда, как в контрольной группе его частота составила 2%.

У женщин с нарушением фертильности отмечается статистически значимое уменьшение доли генотипа  667Т/Т в гене MTHFR, а также генотипов, содержащих аллель A2756G в гене MTR. Генотипы, содержащие полиморфные аллели G в позиции 122 гена  MTRR у женщин с нарушением функции репродукции были более редкими по сравнению с фертильными женщинами.

Отсутствие достоверных различий, по-видимому, связано с размерами изучаемых групп. У женщин с бесплодием отмечается увеличение доли генотипа 20210 А/G в гене протромбина (FII).

Статистически значимых отклонений частот генотипов, содержащих аллель 667Т в гетерозиготном состоянии гена MTHFR у фертильных женщин и у женщин с нарушением репродуктивности, выявлено не было, по-видимому,  за счет размеров исследуемой выборки.

Полученные тенденции, в целом подтверждают результаты многих работ [8],[11] в пользу влияния полиморфизмов генов фолатного обмена (MTHFR, МТR, MTRR) и протромбина (FII) на развитие не только привычного невынашивания беременности, но и бесплодия.

Примечательно, что в 96% случаев пациентов с бесплодием встречаются сочетания  полиморфных аллелей исследуемых генов фолатного обмена и протромбина.

Изучаемые гены задействованы в одном каскаде, и поэтому высоковероятно наличие межгенных взаимодействий генов этих белков [13].

Так, в нашем исследовании у 4% женщин, 8% мужчин и 16% супружеских пар было выявлено  статистически значимое гомозиготное носительство полиморфных аллелей A2756G гена MTR и Т667Т MTHFR одновременно. В контрольной группе такое распределение генотипов выявлено не было.

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                  

            В группе мужчин около 30% пациентов имели такое распределение генотипов, при котором имелось гетерозиготное носительство полиморфного аллеля Т667 MTHFR и гомозиготное носительство нормальных аллелей гена 122А MTRR. Такое же распределение генотипов было выявлено у 25 %.

Приблизительно треть супружеских пар (34%) и 12% женщин имели распределение аллелей, при котором пациент имел гомозиготное носительство полиморфной аллели 667Т гена MTRR, был гетерозиготой по гену MTHFR и являлся гомозиготой с нормальными аллелями A2756по гену MTR.

В контрольной группе этот показатель составляет всего 7%.

            Так же было установлено, что 50% супружеских пар (хотя бы у 1 из супругов) и 33% мужчин имели гетерозиготное носительство гена MTHFR и при этом являлись гомозиготами с нормальными аллелями по генам A2756 MTR и А122 MTRR. В контроле этот показатель составил 11%.

            Сочетанный анализ показал, что у 50% супружеских пар с бесплодием имеется хотя бы у одного из супругов гомозиготная мутация одного из генов фолатного обмена. У группы мужчин этот показатель составил 30%, а у  женщин – 25%.

   Однако, у 80% женщин и мужчин имеется гетерозиготное носительство хотя бы одного полиморфного аллеля одного из генов фолатного обмена.

В группе супружеских пар такое носительство полиморфных аллелей хотя бы у одного из супругов было встречено в 100% пар.

Известно, что дефекты генов фолатного обмена проявляются в организме,   прежде всего накоплением гомоцистеина [10].  Гомоцистеин обладает выраженным токсическим свойством, при этом негативные воздействия, оказываемые им, очень разнообразны.

Так, у мужчин и женщин  с нарушением фертильности в 64% случаев полиморфизм генов фолатного обмена ассоциирован с количеством  широкоплазменных лимфоцитов,  превышающих допустимое  значение (10%).

У мужчин и женщин с полиморфизмом генов гемостаза (MTHFR, МТR, MTRR и FII) отмечается повышенное содержание эозинофилов.

Показано, что в более чем в половине случаев причиной тромбозов является тромбофилия, т.е.

нарушение гемостаза, обусловливающие склонность к развитию тромбозов кровеносных сосудов  различного калибра и локализации [9].

Достаточно хорошо изучены механизмы развития тромбоза при дефиците  естественных антикоагулянтов при мутации в гене фактора V(Leiden) и  20210G/A в гене протромбина (F П) [12].

В последние годы отмечен значительный рост числа исследований, посвященных гипергомоцистеинемии (ГГЦ) как одной из причин, обусловливающих развитие тромбофилии. Гомоцистеин вызывает повреждение эндотелиальной выстилки сосудов и запускает процессы коагуляции.

Возможно и по этой причине, у пациентов с генотипом (МТHFR С/Т, Т/Т + MTRR G/G) в 70 % случаев отмечается тромбоцитоз. В формуле тромбоцитов преобладают юные формы.

У трети из них в крови отмечается анемия  в анамнезе и в настоящее время, подтвержденная снижением гемоглобина.

В фиксированных мазках периферической крови определяются гипохромные эритроциты, с наличием анизоцитоза. Витамины В12 и фолиевая кислота принимает участие в синтезе ДНК и РНК и, в частности, клеток эритроцита. Поэтому при его дефиците  нарушается структура эритроцитов. Замедляется процесс созревания и дифференцировки клеток в костном мозге [3].

Статистически достоверных различий с показателями фертильных мужчин и женщин нет, по-видимому  за счет малого размера исследуемой выборки, при ее увеличении  тенденции будут иметь статистически значимые значения.

Таким образом, выявленные различия в частотах полиморфных аллелей в изучаемых группах согласуются с  данными литературы о важной роли фолатного обмена, в частности  полиморфизмов MTHFR С677Т  и MTRR A122G  в патогенезе нарушения фертильности. Полиморфизм генов фолатного обмена  и протромбина ассоциирован с повышением  уровня тромбоцитов, эозинофилов и широкоплазменных лимфоцитов в периферической крови.

Исследование выполнено при поддержке Carl Zeiss в рамках «Программы поддержки научно-исследовательской работы молодых ученых России».

Литература:

  1. Луговская С.А., Почтарь М.Е. Гематологический атлас / -М., 2004, -С 234-235.
  2. Реутова Н.Н., Лемешко А.А., Цапко Л.П. Частота наследственных тромбофилий у пациенток с привычной потерей беременности в ранних сроках //Материалы IV съезда акушеров-гинекологов России.: Тез. докл.  – М., 2008. -С.219.
  3. Бескоровайная Т.С. Влияние некоторых генетических факторов на нарушение  ре-продукции у человека: Дис…канд. мед. наук. — М., 2005. — 89 с
  4. Козинец Г.И. Атлас клеток крови и костного мозга: Учебное пособие. — М., Изд-во «Триада-Х»., 1998, -С75-90
  5. Макацария А.Д., Бицадзе В.О., Акиньшина С.В. Тромбозы и тромбоэмболии в акушерско-гинекологической клинике. Молекулярно-генетические механизмы и стратегия профилактики тромбоэмболических осложнений //Материалы VI российского форума «Мать и дитя».:  Тез. Докл. -М., 2007. — Т.1. — С. 9.
  6. Юшканцева С.И., Быков В.Л. Гистология, цитология и эмбриология. Краткий курс: Учебное пособие.- СПб.: Издательство «П-2», 2006, -С 96.
  7. Кузнецов С.Л., Мушкамбаров Н.Н., Горячкина В.Л. Атлас по гистологии, цитологии и эмбриологии: Учебное пособие, — М.: Медицинское информационное агентство, 2002.

—    С. 45-55.

  1. Hobbs C.A., Sherman S.L. Polymorphisms in Genes Involved in Folate Metabolism as Maternal Risk Factors for Down Syndrome // Am J Hum Genet. — 2000. — V. 67. — Р. 623-630.
  2. Блинов М.Н., Капустин С.И., Кобилянская В.А., Папаян Л.П. Молекулярная диагностика тромбофилий.В кН.:Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза/Под ред. ЗС. Баркагана и А.П. Момота .- М.:Ньюдиамед, 2001.- С.296
  3. Жлоба А.А. Лабораторная диагностика при гипергомоцистеинемии //Клинико-лабораторный консилиум.. 2009. №1(26).- С.49-60.
  4. Жлоба А.А. Лабораторная диагностика при гипергомоцистеинемии //Клинико-лабораторный консилиум. Лекция 2. Часть 2 2009. №2(27) –С.64-71.
  5. Шмелева В.М., Капустин С.И., Блинов М.Н., Папаян Л.П. Гипергомоцистеинемия-значимый предиктор развития и неблагоприятного клинического течения венозных тромбозов.// Клинико-лабораторный консилиум.. 2009. №1(26).- С.61-68.
  6. Сидельникова В.М. Привычная потеря беременности. М.: Триада-Ч. 2002.39, 46, 70, 102.

Оставьте комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *